Ulrike Marsky Bioensayos de campo o «Test de Pettis» para detectar la resistencia del ácaro varroa en el colmenar: Lo que debes tener en cuenta.
Por la Dra. Ulrike Marsky, Directora Técnica, Véto-pharma.
Poco después de que se autorizaran los primeros acaricidas como respuesta a la propagación de Varroa destructor, apicultores de todo el mundo experimentaron el fenómeno de la resistencia a los acaricidas en sus colmenares.1-2-3 En otras palabras, los tratamientos que habían estado usando con éxito durante varios años ya no eran tan eficientes.
La resistencia se desarrolla después del contacto repetido de los ácaros varroa con un ingrediente activo específico (sustancia química) a lo largo del tiempo.4 El activo, que mata a los ácaros, impone una alta presión de selección sobre la población de varroa. Esto significa que encontrar un mecanismo con el que volverse menos sensible, o resistente, contra un ingrediente activo es literalmente una cuestión de vida o muerte para los ácaros, ya que aquellos ácaros que son menos sensibles hacia el ingrediente activo tienen más probabilidades de sobrevivir a un tratamiento y reproducirse. Como resultado, estos ácaros tienen más probabilidades de transmitir sus genes (incluidos aquellos responsables del desarrollo de la resistencia contra un ingrediente activo específico) a la siguiente generación.4
Diferenciar la resistencia a los acaricidas de otras causas de baja eficacia o fallo del tratamiento no siempre es fácil. Observar y monitorear las colmenas a lo largo de la temporada, centrándose especialmente en cómo varía el nivel de infestación es crucial en este contexto. Conocer los niveles de infestación a lo largo de la temporada puede ayudar a identificar las «colonias súper infestadas» desde el principio. Esto es importante para poder tratar a tiempo y prevenir la propagación de los ácaros varroa en todo el colmenar. Comparar los niveles de infestación de ácaros justo antes y después de aplicar un tratamiento contra varroa es otro elemento importante para evaluar el éxito del tratamiento en el campo, pero hay que tener en cuenta que factores como la reinfestación, la deriva o la carga parasitaria previa al tratamiento también influyen en los resultados.
El desarrollo global de resistencias del ácaro varroa contra diferentes sustancias activas llevó rápidamente a apicultores e investigadores a formularse la siguiente pregunta: ¿Cómo podrían los apicultores reconocer, con una simple prueba en el campo, si las poblaciones de ácaros varroa en ciertas colmenas son resistentes a uno u otro ingrediente activo?
En Estados Unidos, la idea de una herramienta de campo rápida y sencilla para que los apicultores pudieran detectar la presencia de ácaros resistentes en sus colmenares, surgió por primera vez en la década de 1990 cuando se empezó a sospechar la resistencia al fluvalinato, que sería confirmada posteriormente.3 El Dr. Jeff Pettis, del Laboratorio de Investigación de Abejas del ARS en Beltsville, Maryland, junto con sus colegas, publicó en 1998 un protocolo para que los apicultores pudieran realizar un bioensayo de campo.5 La idea detrás del ensayo era desarrollar una herramienta que fuera sencilla para los apicultores, que no requiriera equipo especializado y que les ayudara a detectar la resistencia antes de aplicar el tratamiento contra varroa. Esto les permitiría aumentar la tasa de supervivencia de sus colonias y, al mismo tiempo, ahorrar dinero y aplicar un tratamiento diferente (y eficiente) en caso de que sus poblaciones de ácaros fueran resistentes al fluvalinato.6 En el caso del fluvalinato, obtener una mortalidad de ácaros en el bioensayo inferior al 50% indicaría resistencia, y por debajo del 25% indicaría resistencia total.6 Por lo tanto, en lugar de un enfoque de “científico” que expondría a los ácaros varroa a sustancias químicas en condiciones controladas en el laboratorio, el objetivo era proporcionar a los apicultores una herramienta simplificada y rápida para utilizar en el colmenar.
El principio básico de los bioensayos de campo es el siguiente: Los apicultores llevan consigo al colmenar cierto equipamiento, que incluye un frasco u otro recipiente similar, un pedazo de la tira del acaricida a probar, una taza para utilizar de medidor, un cubo, papel blanco, solución alcohólica y otras herramientas. Toman una muestra de abejas (y, por lo tanto, del ácaro varroa adjunto) del área de cría de sus colmenas, evitando incluir a la reina en la muestra. Luego, exponen la muestra al pedazo de tira del acaricida durante un período de tiempo predefinido y, una vez transcurrido el tiempo de incubación, cuentan los ácaros muertos en un cubo o un trozo de papel blancos. Posteriormente, se realiza un lavado con alcohol de la muestra de abejas para detectar todos los ácaros que no murieron durante el tiempo de incubación.
La tasa de mortalidad de los ácaros durante el tiempo de incubación (periodo de tiempo que estuvieron expuestos al acaricida) puede ser entonces calculada, representando el porcentaje de ácaros sensibles en la muestra frente a los resistentes (resistentes = ácaros supervivientes que no murieron durante el tiempo de incubación). 5-7
En los últimos años, se ha informado de la presencia de ácaros varroa resistentes a amitraz en algunas regiones de Francia y Estados Unidos8. A pesar de la menor difusión y la aparición más dispersa de la resistencia al amitraz en comparación con otros acaricidas como, por ejemplo, los piretroides, varios investigadores han trabajado desde entonces en el desarrollo de un bioensayo de campo para los apicultores que se adapte específicamente a esta molécula. La mayoría de ellos han utilizado el tratamiento autorizado con tiras de amitraz, Apivar, para exponer a los ácaros presentes en una muestra de abejas al amitraz. El tiempo de exposición de los ácaros varroa hacia el ingrediente activo ha sido variable (desde 2 horas hasta 24 horas) y se han explorado diferentes tamaños del pedazo de tira de Apivar, así como diferentes métodos para fijar la tira dentro del recipiente con la muestra de abejas (y de ácaros). 9-10
En general, dentro de los factores a considerar en los protocolos de bioensayo se incluyen los relacionados con la fecha de caducidad y el empaquetado de las tiras de prueba utilizadas en los ensayos. Todos los tratamientos contra varroa basados en la aplicación de tiras con diferentes ingredientes (amitraz, flumetrina, coumafós) tienen una vida útil específica, y cada lote producido del producto tiene una fecha de vencimiento. Por supuesto, estas fechas no solo deben ser respetadas cuando se aplican las tiras como tratamiento contra varroa en las colmenas, sino también cuando se utilizan para detectar resistencias en el colmenar.
Aunque el paquete original de las tiras debe abrirse para acceder a ellas y cortarlas en piezas más pequeñas para un bioensayo de campo, se debe evitar enviar tiras o piezas de tiras en un empaque diferente al del producto original. Tan pronto como se abre el paquete original sellado de un producto, comienza el proceso de degradación debido a la exposición al aire (más precisamente, oxígeno) y la luz solar.
Además, debe considerarse especialmente el momento del año en que se realizan los bioensayos de campo, siendo antes de la temporada de tratamiento el periodo más indicado. De esta manera, los apicultores pueden estimar la sensibilidad de las poblaciones de ácaros varroa de sus colmenares hacia una molécula específica antes de elegir el acaricida, aunque no les permite predecir la eficacia exacta en campo de un tratamiento autorizado.
Los protocolos de bioensayo para detectar resistencias al amitraz han sido propuestos por Pettis (2019)9, Higes et al. (2020)10 y otros. Los diferentes protocolos varían principalmente en tres detalles metodológicos:
1. El control de la temperatura ambiente durante el ensayo.
2. El período de tiempo durante el cual los ácaros están expuestos a la sustancia activa (amitraz).
3. El tipo de muestra: muestra de abejas (incluidos sus ácaros varroa) frente a muestra de ácaros varroa únicamente (obtenidos de la cría operculada y transferidos a placas de Petri o viales de vidrio).
Pettis (2019) encontró una menor mortalidad de ácaros en ensayos realizados a temperaturas de 21 °C en comparación con ensayos realizados a 32 °C. El protocolo de Higes et al. (2020) se basó en un enfoque más controlado, exponiendo los ácaros al amitraz a una temperatura constante de 34°C. Por el contrario, el protocolo propuesto por Rinkevich (2020)11 no sugirió ningún tipo de control de temperatura sobre las muestras de abejas (y ácaros) durante la exposición al amitraz. Por supuesto, se podría argumentar que el requisito de mantener las muestras de abejas (y ácaros) a una temperatura constante reduce la practicidad en el campo.
Sin embargo, el Ministerio de Agricultura de Columbia Británica ya publicó un protocolo del Test de Pettis para amitraz en 2015.12 Este protocolo sugiere varias alternativas para proporcionar un mínimo control de la temperatura ambiente en el campo:
«Coloque los frascos en una incubadora o en una habitación cálida, en la oscuridad, durante 6 horas. Alternativamente, coloque los frascos en una nevera portátil con un par de botellas de agua caliente. Rellene las botellas con agua caliente después de las primeras 3 horas. Asegúrese de que las tapas de los frascos no estén cubiertas para que las abejas tengan aire».
El protocolo, similar a la propuesta original de los bioensayos de campo publicado por Pettis, incluye la siguiente advertencia: “Este ensayo tiene como objetivo detectar ácaros resistentes y no tiene la intención de indicar el nivel exacto de resistencia”.12
El efecto potencial de la temperatura en los resultados de los bioensayos no debe subestimarse en futuras pruebas y debería ser evaluado para diferentes protocolos.
En cuanto al tiempo de exposición, Pettis (2019) y el Ministerio de Columbia Británica (2015) sugieren 6 horas de exposición de la muestra de abejas al amitraz. Los tiempos de exposición más cortos suelen corresponder a los bioensayos de laboratorio9-12 o a la combinación de bioensayos de laboratorio y campo, como el protocolo sugerido por Higes y cols. (2020)10. El protocolo de Rinkevich (2020)11 es el único bioensayo de campo (que trabaja con muestras de abejas tomadas del colmenar, exponiéndolas a tratamientos con tiras y sin controlar la temperatura ambiente) que recomienda un período de exposición más corto de tres horas.11
La relevancia del periodo de exposición en los bioensayos ha sido también discutida entre los expertos. Si bien algunos han sugerido la posibilidad de obtener resultados falsamente negativos (poblaciones de varroa clasificadas erróneamente como «sensibles») con tiempos de exposición más largos, el principal factor que determina el tiempo límite de exposición en el campo probablemente sea la viabilidad de los ácaros varroa. Al observar los períodos de exposición sugeridos en los diferentes ensayos (tanto de campo como de laboratorio), los tiempos generalmente varían entre 1 y 6 horas. En los ensayos de laboratorio, cuando los ácaros varroa no tienen acceso al huésped del que alimentarse (abejas o larvas), la viabilidad puede jugar un papel más importante y los tiempos de exposición suelen ser más cortos. Sin embargo, en los ensayos de campo con los ácaros varroa sobre las abejas y alimentándose de ellas, su probabilidad natural de supervivencia (sin exposición al ingrediente activo) puede no diferir significativamente entre las 3 y las 6 horas. Si un período de exposición de 6 en lugar de 3 horas aumentaría significativamente la mortalidad del ácaro por razones distintas al contacto con el ingrediente activo, todavía no ha sido clarificado. No obstante, dado que el objetivo principal de un bioensayo de campo es determinar la sensibilidad o resistencia hacia una sustancia activa, la obtención de resultados falsamente positivos (población de varroa clasificada erróneamente como «resistente») debe evitarse eligiendo períodos de exposición lo suficientemente largos. 9-12
En el protocolo de Higes et al. (2020), en lugar de exponer toda la muestra de abejas, se toma una muestra de los ácaros varroa individualmente y se exponen a un trozo de tira de amitraz en una placa de Petri en grupos de 15.10 La exposición en ensayos como este es mucho menos dependiente de la actividad de la muestra de abejas. La exposición de los ácaros varroa hacia el ingrediente activo es más inmediata, ya que los ácaros entran directamente en contacto con un tratamiento en tira o una placa de Petri recubierta con la sustancia activa. Por supuesto, muestrear ácaros de forma individual y exponerlos al amitraz a una temperatura controlada es menos conveniente para los apicultores en el campo. Sin embargo, permite un procedimiento más estandarizado bajo condiciones de laboratorio.
En general, los investigadores, técnicos y expertos en apicultura que trabajan en el desarrollo de bioensayos de campo para su uso generalizado en la apicultura, deben ser conscientes de la responsabilidad de sopesar la fiabilidad de los resultados frente a la facilidad de uso y la practicidad en el campo. Se debe reconocer la necesidad de los apicultores de realizar pruebas rápidas de resistencia en el campo pero, si es posible, sin descartar metodologías que aunque pudieran dificultar ligeramente el protocolo, podrían mejorar significativamente la fiabilidad de los resultados del ensayo en el campo.
Esto es especialmente importante para que los veterinarios y técnicos apícolas puedan recomendar la realización de bioensayos como una herramienta diagnóstica para detectar la presencia de resistencias en un colmenar. No obstante, la interpretación de los resultados de los bioensayos incluye la distinción entre la sensibilidad del ácaro (sensible vs. resistente) y la eficacia en el campo de un tratamiento autorizado, ya que uno no es igual al otro. De hecho, clasificar los ácaros varroa en función de los porcentajes de mortalidad obtenidos en los bioensayos como «sensibles», «mayormente sensibles» o «resistentes» es bien intencionada, pero algo arbitraria.15 Se requieren esfuerzos continuos para investigar protocolos de bioensayos de campo para detectar resistencias a amitraz en el colmenar que permitan satisfacer las necesidades de los apicultores respetando los estándares metodológicos requeridos para obtener resultados fiables y reproducibles.
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3- Elzen, Patti J., et al. “Detection of resistance in US Varroa jacobsoni Oud. (Mesostigmata: Varroidae) to the acaricide fluvalinate.” Apidologie 30.1 (1999): 13-17.
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5- Pettis J.S., Shimanuki H., Feldlaufer M.F. (1998) An assay to detect fluvalinate resistance in Varroa mites, Am. Bee J. 138, 538–541.
6- Suszkiw, Jan. “Easy-to-use bioassay spots Varroa resistance.” Agricultural Research 53.4 (2005): 19.
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9-Pettis, Jeff S.” Refine and validate a field assay to detect amitraz resistance in Varroa.” Project Apis m. (2019) (unpublished).
10- Higes, M., Martín-Hernández, R., Hernández-Rodríguez, C.S. et al. Assessing the resistance to acaricides in Varroa destructor from several Spanish locations. Parasitol Res 119, 3595–3601 (2020).
11- Rinkevich FD (2020) Detection of amitraz resistance and reduced treatment efficacy in the Varroa Mite, Varroa destructor, within commercial beekeeping operations. PLOS ONE 15(1): e0227264.
12- British Columbia – Ministry of Agriculture. “Pettis Test – Detecting Varroa Mite Resistance to Apistan, Apivar & Coumaphos.” 2015: Apiculture Bulletin #223.
13- Marsky, U. et al. (2020) „Varroa mite sensitivity towards amitraz in France.” COLOSS Conference (October 2020).
14- Almecija, Gabrielle, et al. “Inventory of Varroa destructor susceptibility to amitraz and tau-fluvalinate in France.” Experimental and Applied Acarology 82.1 (2020): 1-16.
15- Morfin, Nuria, et al. “Surveillance of synthetic acaricide efficacy against Varroa destructor in Ontario, Canada.” The Canadian Entomologist 154 (2022).
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